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結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑

注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需闡述具體理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對注冊申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對其科學(xué)合理性進行驗證，提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、范圍

本指導(dǎo)原則所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑是指：利用分子生物學(xué)技術(shù)，對結(jié)核病患者的臨床樣本或培養(yǎng)物樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變進行體外定性檢測的試劑。針對該定義，需要強調(diào)如下幾點。

1.適用人群為：結(jié)核病患者。特別注意的是，對于同一注冊單元內(nèi)可同時進行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，盡管其核酸檢測部分的適用人群為疑似結(jié)核病患者，但只有核酸陽性才能進行下一步的耐藥基因突變檢測，因此其耐藥基因突變檢測部分的適用人群為結(jié)核病患者。

2.適用樣本可為：

2.1痰、支氣管肺泡灌洗液或其他體液等臨床樣本或培養(yǎng)物樣本；

2.2進行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測的上述樣本應(yīng)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的樣本。即：來自結(jié)核病患者的、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的痰、支氣管肺泡灌洗液或其他體液等臨床樣本或培養(yǎng)物樣本。

3.結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法可為：已獲國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測試劑或臨床普遍認(rèn)可的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定方法（如：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑或傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群培養(yǎng)鑒定方法）。

4.對于同一注冊單元內(nèi)可同時進行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，其耐藥基因突變檢測部分適用于本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則所述產(chǎn)品的預(yù)期用途可表述為以下三種類型：

1.申報產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報告具體突變類型（a類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括zz，本產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型。

2.已知申報產(chǎn)品可檢測的具體突變類型（如：針對具體突變類型設(shè)計特異突變探針，從檢驗原理上已知可檢測哪些突變類型），但結(jié)果不區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報告為耐藥/敏感等（b類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括zz，本產(chǎn)品不區(qū)分具體突變類型。

3.某段核酸區(qū)域的突變可導(dǎo)致對某種藥物耐藥，申報產(chǎn)品從檢驗原理上沒有必要明確具體突變類型，結(jié)果報告為耐藥/敏感（c類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的xx樣本中的yy耐藥，本產(chǎn)品無法明確具體突變類型。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法確立的，對于線性雜交或基因芯片等其他核酸檢測技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本指導(dǎo)原則所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，注冊申請人可根據(jù)產(chǎn)品特性選擇合適的方法進行評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證其科學(xué)合理性，同時確認(rèn)性能評價的充分性。本指導(dǎo)原則適用于進行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從檢測靶標(biāo)、方法學(xué)及不同基因突變類型檢出能力等方面寫明申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若尚無同類產(chǎn)品批準(zhǔn)上市，則應(yīng)提交詳實充分的科學(xué)證據(jù)，包括：突變區(qū)域、突變類型與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群表型耐藥的相關(guān)性以及突變檢測的臨床意義，證明申報產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)具有明確的臨床意義。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料的研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定，并提交工藝驗證報告；如主要原材料購自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

1.核酸分離純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

2.PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應(yīng)提交對純度、濃度以及保存穩(wěn)定性等的驗證資料。

2.2引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對分子量、純度、穩(wěn)定性以及功能性實驗等的驗證資料。如為外購，還應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

2.3探針

特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化，在5-端（和/或3-端）進行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達到HPLC純。應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜，應(yīng)對探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光素進行核實，并進行功能性試驗驗證。

2.4酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對酶活性進行合理驗證。

3.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）污染。

4.企業(yè)參考品：詳細(xì)說明企業(yè)參考品的原料選擇、制備和定值過程等試驗資料。

4.1陽性參考品

應(yīng)包括申報產(chǎn)品聲稱的全部突變類型。陽性參考品的突變類型需經(jīng)過金標(biāo)準(zhǔn)方法或已上市同類分型試劑的確認(rèn)。常見突變類型的陽性參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型的陽性參考品可以采用含有突變的核酸（如：結(jié)核分枝桿菌基因組DNA或質(zhì)粒），不建議采用臨床樣本（如痰液）作為陽性參考品。注冊申請人可根據(jù)權(quán)威機構(gòu)的最新文件或文獻等確定常見突變類型，并提交相應(yīng)的支持資料。

4.2陰性參考品

可采用經(jīng)確認(rèn)靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌菌株、申報產(chǎn)品聲稱的其他無關(guān)突變類型的核酸等。

4.3最低檢測限參考品

最低檢測限參考品須含有聲稱的所有突變類型。常見突變類型的最低檢測限參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽性參考品”。

4.4精密度參考品

精密度參考品至少應(yīng)包括弱陽性（低濃度突變型）水平，須含有申報產(chǎn)品聲稱的所有突變類型。常見突變類型的精密度參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽性參考品”。

對于c類預(yù)期用途的產(chǎn)品，申請人應(yīng)盡可能對國內(nèi)已報告的耐藥核酸區(qū)域內(nèi)的常見突變類型設(shè)置上述各種類型的企業(yè)參考品。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽性參考品”。對于利福平耐藥基因突變檢測試劑，陽性參考品、最低檢測限參考品以及精密度參考品至少應(yīng)包括4—5種常見突變類型，并且至少有1—2種突變類型采用菌株。對于其他藥物的耐藥基因突變檢測試劑，陽性參考品、最低檢測限參考品以及精密度參考品至少應(yīng)包括耐藥相關(guān)的常見突變類型，并且至少應(yīng)有1—2種突變類型采用菌株，突變類型的數(shù)量可根據(jù)申報產(chǎn)品的具體情況而定。

5.試劑盒內(nèi)的對照

申報產(chǎn)品的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種對照來實現(xiàn)，以對樣本核酸分離純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染和靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果進行合理質(zhì)控。申報資料應(yīng)詳細(xì)說明各種對照的原料選擇、制備和定值過程等。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對于采用該方法學(xué)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑，建議至少設(shè)置陽性對照、內(nèi)對照和陰性對照。

5.1陽性對照

陽性對照可對實驗過程進行質(zhì)控。陽性對照可采用菌株、質(zhì)粒或基因組提取物等。企業(yè)應(yīng)對陽性對照相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確要求。

5.2內(nèi)對照

內(nèi)對照可對實驗過程的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制。內(nèi)對照可采用質(zhì)粒或線性DNA等。申請人應(yīng)對內(nèi)對照的引物、探針和模板濃度做精確的驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性又要盡量降低對靶核酸序列檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。企業(yè)應(yīng)對內(nèi)對照或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確要求。

5.3陰性對照

陰性對照可采用含有野生型靶序列的核酸或空白對照，以對交叉污染造成的假陽性結(jié)果進行質(zhì)控。陰性對照需參與樣本核酸的平行提取純化。

由于申報產(chǎn)品所適用的臨床樣本比較復(fù)雜，其中可能含有各種影響PCR反應(yīng)的抑制物，造成假陰性。因此，申報產(chǎn)品應(yīng)充分考慮對樣本核酸提取純化環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，通過設(shè)置各種對照進行質(zhì)控。比如，采用克隆菌株作為內(nèi)對照或陽性對照并參與樣本核酸的平行提取純化，或者設(shè)置專門的核酸提取純化對照（如菌株）等，以對樣本核酸提取純化的質(zhì)量及效率進行評估。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件和質(zhì)控體系設(shè)置等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率、離子濃度等關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制。主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度以及陽離子濃度等。

3.PCR反應(yīng)各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

4.對于基線閾值和閾值循環(huán)數(shù)等確定的研究資料。

5.如申報產(chǎn)品包含核酸提取純化試劑，應(yīng)提交對核酸提取純化過程進行工藝優(yōu)化的研究資料。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交對申報產(chǎn)品進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體試驗方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。該類產(chǎn)品建議著重對以下分析性能進行研究。

1.陽性/陰性參考品符合率

各突變類型的陽性參考品均應(yīng)檢出陽性/耐藥，陰性參考品應(yīng)檢測為陰性/敏感。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽性參考品”。

2.最低檢測限

建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。擴增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的DNA量越多，則越容易檢出。而終體系中的這兩個因素是由臨床樣本中的結(jié)核分枝桿菌耐藥菌與野生菌的含量和相對比例決定的。因此，需從以下兩個方面考察申報產(chǎn)品的最低檢測限。

2.1 100%耐藥比例下，耐藥菌株/突變核酸的最低檢測濃度

將結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株/突變核酸進行系列稀釋，制備不同濃度的耐藥菌株/突變核酸樣本。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有相應(yīng)突變的核酸樣本（如：質(zhì)?；蚧蚪MDNA）。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽性參考品”。

分別對各濃度樣本進行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為可檢測的最低耐藥菌株/突變核酸濃度。

2.2不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限。

配制不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的混合液：將不同濃度的結(jié)核分枝桿菌野生菌株和耐藥菌株進行混合，調(diào)整野生和耐藥菌株的比例，得到含不同菌株濃度和各種耐藥比例的菌株混合液。或者，將不同濃度的野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒進行混合，調(diào)整野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒的比例，得到含不同核酸濃度和各種耐藥比例的核酸混合液。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本（如：質(zhì)粒或基因組DNA）。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽性參考品”。

對各份混合液進行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限。

為確定痰樣本的最低檢測限，建議將至少1株結(jié)核分枝桿菌耐藥/敏感菌株、結(jié)核分枝桿菌陰性的痰樣本進行混合，完全按照申報產(chǎn)品的操作步驟對此“制備痰液”進行樣本前處理、核酸提取純化和擴增等。對結(jié)核分枝桿菌陰性痰樣本的確認(rèn)，應(yīng)采用涂片、培養(yǎng)鑒定、臨床診斷和其他已上市的核酸檢測試劑盒進行聯(lián)合確認(rèn)。

應(yīng)明確每種菌株/核酸的來源、突變類型、濃度和制備方法等信息。

企業(yè)可采用適宜方法進行菌株濃度的確認(rèn)，可采用鋪板計數(shù)細(xì)菌集落形成單位（colony forming unit，CFU）的方法進行菌株濃度的確認(rèn)，以CFU/mL作為菌株濃度的表示方式；也可采用國家參考品對菌株濃度進行標(biāo)定，以“個菌/mL”作為菌株濃度的表示方式。

3.分析特異性

3.1野生型驗證：采用不同濃度的野生型結(jié)核分枝桿菌進行驗證，結(jié)果應(yīng)為敏感或陰性。

3.2申報產(chǎn)品聲稱的全部突變類型間的交叉反應(yīng)驗證。

3.3對于痰等復(fù)雜的臨床樣本類型，鑒于可檢測樣本中可能同時含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，為了驗證非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群等其他病原體對申報產(chǎn)品的檢測結(jié)果是否造成假陰性和假陽性結(jié)果，需對核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體進行交叉反應(yīng)的驗證。

用于交叉反應(yīng)研究的其他分枝桿菌具體包括：堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、土地分枝桿菌、次要分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、偶然分枝桿菌、胃分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、草分枝桿菌。上述細(xì)菌均應(yīng)進行驗證。

用于交叉反應(yīng)研究的其他病原體具體包括：肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、隱球菌、金黃色葡萄球菌、諾卡氏菌、綠膿桿菌、白色念珠菌。上述病原體均應(yīng)進行驗證。

對于培養(yǎng)物樣本類型，3.3項不適用。

4.干擾物質(zhì)

4.1潛在干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（不含待檢野生/突變靶標(biāo)的相應(yīng)臨床樣本）和外源性藥物。建議使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（最差條件）條件下進行評價。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應(yīng)藥物藥代動力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進行干擾驗證。具體目錄參見表3。

用于干擾研究的外源性藥物具體包括：異煙肼、利福平、抗生素（如：阿莫西林、左氧氟沙星）、鼻腔噴霧劑或滴鼻劑（如：腎上腺素、羥甲唑啉、含防腐劑的氯化鈉溶液）、鼻用軟膏類（如：莫匹羅星）、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、抗病毒藥（如：扎那米韋）、鼻腔糖皮質(zhì)激素（如：倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松）。上述外源性藥物均應(yīng)進行驗證，括號內(nèi)至少選做一種。

對于培養(yǎng)物樣本類型，4.1項不適用。

4.2對于培養(yǎng)物樣本，干擾物質(zhì)主要為適用培養(yǎng)基和相關(guān)藥物的干擾，應(yīng)在最低檢測限濃度/陰性條件下驗證相關(guān)藥物和培養(yǎng)基對檢測結(jié)果的影響，明確不產(chǎn)生干擾的最大培養(yǎng)基和藥物濃度。

5.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實驗方法可以參考國內(nèi)或國外的相關(guān)文件進行。企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。針對申報產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

5.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報產(chǎn)品（包括提取純化組分和PCR組分）本身的影響外，還應(yīng)對不同的適用機型（如PCR分析儀）、操作者和地點等要素進行相關(guān)的驗證。

5.2 合理的精密度評價周期，例如：為期至少12天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。

5.3 建議在以下3個濃度進行驗證：

5.3.1陰性樣本：靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌野生型菌株，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

5.3.2弱陽性樣本：耐藥菌株/突變核酸濃度略高于申報產(chǎn)品的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。（弱陽性樣本應(yīng)包括申報產(chǎn)品聲稱的所有突變類型。常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。）

5.3.3中等陽性樣本：耐藥菌株/突變核酸濃度約為最低檢測限的2倍或3倍，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。（可選擇申報產(chǎn)品聲稱的部分突變類型進行驗證，但至少應(yīng)包括1株結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株。）

6.不同樣本前處理方法和核酸提取純化方法的分析性能資料要求

如果某種樣本類型可采用幾種方法進行樣本前處理（如：痰/痰沉淀物），申請人應(yīng)提交適用的樣本前處理方法（進行全項目分析性能評估的樣本前處理方法除外）與后續(xù)試驗配合進行的性能試驗（至少包括最低檢測限項目），以證明不同的樣本前處理方法不影響檢測結(jié)果。

如果某種樣本類型可采用幾種方法進行核酸提取純化，申請人應(yīng)提供適用的核酸提取純化方法（進行全項目分析性能評估的核酸提取純化方法除外）與后續(xù)試驗配合進行的性能試驗（至少包括最低檢測限和精密度項目），以證明不同的核酸提取純化方法不影響檢測結(jié)果。

對于c類預(yù)期用途的產(chǎn)品，申請人應(yīng)對國內(nèi)已報告的耐藥核酸區(qū)域內(nèi)的常見突變類型進行上述分析性能項目的驗證。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽性參考品”。對于利福平耐藥基因突變檢測試劑，陽性符合率、最低檢測限以及精密度試驗至少應(yīng)包括4—5種常見突變類型，并且至少有1—2種突變類型采用菌株。對于其他藥物的耐藥基因突變檢測試劑，陽性符合率、最低檢測限以及精密度試驗至少應(yīng)包括耐藥相關(guān)的常見突變類型，并且至少應(yīng)有1—2種突變類型采用菌株，突變類型的數(shù)量可根據(jù)申報產(chǎn)品的具體情況而定。

對于適用多個機型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用儀器】項中所列的所有型號儀器的至少三批全性能評估資料。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值確定資料主要是指Ct值/Ct值的差值/熒光信號差值等的確認(rèn)資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。有關(guān)ROC曲線分析的細(xì)節(jié)，請參考國內(nèi)外相關(guān)的文件。如存在灰區(qū)，應(yīng)提交灰區(qū)上下限確定的詳細(xì)研究資料。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報產(chǎn)品的穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

另外，還應(yīng)提供樣本保存條件、保存時間等方面的詳細(xì)研究資料。樣本穩(wěn)定性研究主要包括核酸分離純化前樣本穩(wěn)定性和分離純化后核酸在儲備液中的穩(wěn)定性兩方面。在合理的溫度范圍內(nèi)選擇多個溫度點（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行分析驗證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。

（七）臨床試驗研究

1.臨床試驗機構(gòu)的選擇

申請人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）臨床試驗機構(gòu)，按照相關(guān)規(guī)定開展臨床試驗。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景和病原微生物的特性等因素選擇臨床試驗機構(gòu)。

2.臨床試驗人群：對于僅進行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測的單功能試劑，選擇結(jié)核病患者進行臨床試驗；對于同一注冊單元內(nèi)可同時進行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，盡管其核酸檢測部分的適用人群為疑似結(jié)核病患者，但只有核酸陽性才能進行下一步的耐藥基因突變檢測，因此其耐藥基因突變檢測部分的適用人群為結(jié)核病患者。

3.臨床樣本的要求：進行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測的臨床樣本應(yīng)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的樣本。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法同本指導(dǎo)原則“二范圍”第3條。

4.臨床試驗樣本量

鑒于痰、支氣管肺泡灌洗液以及培養(yǎng)物等樣本之間差異較大，如果申報產(chǎn)品同時適用于上述幾種樣本類型，每種樣本類型的例數(shù)不少于500例。

如果申報產(chǎn)品適用于某種樣本類型的液體培養(yǎng)物和固體培養(yǎng)物，應(yīng)進行不少于150例液體和固體培養(yǎng)物的同源比對試驗（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽性和陰性樣本），證明不同的培養(yǎng)物不會影響檢測結(jié)果。

如果某種樣本類型適用于幾種樣本前處理方法，應(yīng)進行不少于150例樣本的同源比對試驗（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽性和陰性樣本），證明不同的樣本前處理方法不會影響檢測結(jié)果。

如果某種樣本類型適用于幾種核酸提取純化方法，應(yīng)進行不少于150例樣本的同源比對試驗（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽性和陰性樣本），證明不同的核酸提取純化方法不會影響檢測結(jié)果。

臨床試驗應(yīng)盡量采用新鮮樣本，如采用凍存樣本應(yīng)另行說明。

5.對比試劑

5.1對于已有同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

如果選擇已上市同類產(chǎn)品或基因測序作為對比試劑，還需選擇至少200例樣本（敏感和耐藥分別至少100例）進行傳統(tǒng)藥敏試驗（金標(biāo)準(zhǔn)）的驗證。

對于c類產(chǎn)品，除了還需選擇至少200例樣本（敏感和耐藥分別至少100例）進行傳統(tǒng)藥敏試驗（金標(biāo)準(zhǔn)）的驗證外，還需對所有耐藥/陽性樣本采用分子生物學(xué)方法進行驗證，以明確引起耐藥/陽性的具體突變類型。

如果選擇傳統(tǒng)藥敏試驗（金標(biāo)準(zhǔn)）作為對比方法，還需對所有耐藥/陽性樣本采用分子生物學(xué)方法進行驗證，以明確引起耐藥的具體突變類型。

5.2 對于新的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑

對于新的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑，選擇傳統(tǒng)藥敏試驗方法（金標(biāo)準(zhǔn)）和基因測序作為對比試劑。

5.3 陽性樣本例數(shù)的要求

對于a類和b類產(chǎn)品，產(chǎn)品預(yù)期用途中聲稱的每種突變類型均應(yīng)具有一定的陽性例數(shù)，每種突變類型均應(yīng)分別進行統(tǒng)計分析。對于c類產(chǎn)品，應(yīng)盡量對檢測靶核酸區(qū)域內(nèi)的常見突變類型進行驗證。

有關(guān)測序方法的相關(guān)要求，請參考《結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》相關(guān)要求以及現(xiàn)行法規(guī)要求。

6.臨床試驗方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析

6.1應(yīng)在臨床試驗方案或者臨床試驗報告中詳細(xì)描述申報產(chǎn)品和對比試劑的具體操作步驟。

6.2臨床試驗原始數(shù)據(jù)應(yīng)以列表的方式表示，包括樣本的申報產(chǎn)品的結(jié)果、對比試劑的結(jié)果、藥敏結(jié)果以及耐藥比例和臨床診斷（如：何種結(jié)核?。┑?。

6.3對臨床試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。

6.4對于申報產(chǎn)品與對比試劑（對比方法）的等效性評價，常選擇交叉四格表形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床試驗方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價申報產(chǎn)品與對比試劑（對比方法）是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。

6.5結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用金標(biāo)準(zhǔn)（測序或藥敏試驗）或其他合理方法進行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。如無需復(fù)核，應(yīng)詳細(xì)說明理由。

7.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究者應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的樣本入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各臨床試驗機構(gòu)選用的對比試劑應(yīng)保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。另外，申報產(chǎn)品的樣本類型不應(yīng)超越對比試劑對樣本類型的要求。

8.臨床試驗報告的撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗報告應(yīng)對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床試驗報告中對以下內(nèi)容進行詳述。

8.1臨床試驗總體設(shè)計及方案描述

8.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床試驗機構(gòu)選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

8.1.2病例的納入/排除標(biāo)準(zhǔn)。

8.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存；培養(yǎng)、鑒定、藥敏方法等。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法，如采用已獲國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑作為確認(rèn)方法，應(yīng)明確生產(chǎn)廠家和醫(yī)療器械注冊證號等相關(guān)信息；如采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法，應(yīng)詳細(xì)說明培養(yǎng)方法和鑒定方法。

8.1.4統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

8.2具體臨床試驗情況

8.2.1申報產(chǎn)品和對比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息。

8.2.2對各試驗機構(gòu)的病例數(shù)等情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

8.2.3質(zhì)量控制，試驗人員培訓(xùn)、儀器日常維護、質(zhì)控品運行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

8.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本的保存條件、結(jié)果不一致樣本的校驗等。

8.3統(tǒng)計學(xué)分析

8.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或其他合理方法的復(fù)核以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

8.3.2陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。

8.3.3以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

8.4討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床試驗有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

（八）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的其他注冊申報資料保持一致，如某些內(nèi)容引自參考文獻，則應(yīng)采用規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報人員合理編制說明書。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1根據(jù)【檢驗結(jié)果的解釋】的結(jié)果報告形式，【預(yù)期用途】第一段可表述為以下幾種情況：

1.1.1申報產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報告具體突變類型（a類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括zz，本產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型。本產(chǎn)品用于對某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。

1.1.2已知申報產(chǎn)品可檢測的具體突變類型（如：針對具體突變類型設(shè)計特異突變探針，從檢驗原理上已知可檢測哪些突變類型），但結(jié)果不區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報告為耐藥/敏感等（b類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括zz，本產(chǎn)品不區(qū)分具體突變類型。本產(chǎn)品用于對某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。

1.1.3某段核酸區(qū)域的突變可導(dǎo)致對某種藥物耐藥，申報產(chǎn)品從檢驗原理上沒有必要明確具體突變類型，結(jié)果報告為耐藥/敏感（c類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的xx樣本中的yy耐藥，本產(chǎn)品無法明確具體突變類型。本產(chǎn)品用于對某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。

需要特別注意如下幾點：

1.b類預(yù)期用途的試劑所包括的突變類型對同一種（類）藥物必須具有相同的指導(dǎo)用藥的臨床意義。

2.對于c類預(yù)期用途的試劑，申請人必須有充分可靠的科學(xué)證據(jù)證明某段核酸區(qū)域與某種（類）藥物具有明確的臨床意義。申請人必須提供科學(xué)權(quán)威的支持資料，證明：耐藥基因區(qū)域的突變可引起耐藥；耐藥基因區(qū)域的突變對同一種（類）藥物必須具有相同的指導(dǎo)用藥的臨床意義。申請人還應(yīng)提交耐藥基因區(qū)域內(nèi)所有堿基在國內(nèi)外的突變頻率。

1.2介紹與耐藥相關(guān)的檢測靶標(biāo)、檢測靶標(biāo)的突變位點和突變類型（如適用）；明確申報產(chǎn)品可檢測的突變類型或耐藥核酸區(qū)域?qū)е碌谋硇湍退幷寂R床所有表型耐藥的比例。

1.3適用人群：結(jié)核病患者。特別注意的是，對于同一注冊單元內(nèi)可同時進行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，盡管其核酸檢測部分的適用人群為疑似結(jié)核病患者，但只有核酸陽性才能進行下一步的耐藥基因突變檢測，因此其耐藥基因突變檢測部分的適用人群為結(jié)核病患者。

1.4明確臨床試驗驗證過的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法的相關(guān)信息。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組份，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組份，則應(yīng)在此注明經(jīng)過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號和醫(yī)療器械備案號（如有）等詳細(xì)信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒檢測靶標(biāo)以及突變類型（如適用）進行詳細(xì)描述（基因名稱和基因位置、靶序列長度、突變類型（如適用）及相關(guān)特征等），對試劑盒所用探針、引物、突變或耐藥的判定終點等進行詳細(xì)的介紹；對不同樣品反應(yīng)管組合、對照設(shè)置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對其作用機理進行適當(dāng)介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性和凍融次數(shù)要求等，應(yīng)明確具體的儲存條件及有效期。

5.【樣本要求】重點明確以下內(nèi)容：

5.1臨床樣本的收集：建議參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊）》（中華醫(yī)學(xué)會編著）或者《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會編著）現(xiàn)行有效版本推薦的采樣要求或國外的同類文件，并詳細(xì)描述采樣步驟和注意事項。

5.2臨床樣本的前處理：建議參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊）》（中華醫(yī)學(xué)會編著）或者《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會編著）現(xiàn)行有效版本推薦的前處理方法或國外的同類文件，詳細(xì)描述具體的前處理方法。

5.3培養(yǎng)物樣本：詳細(xì)描述培養(yǎng)鑒定方法，包括：從患者采集的臨床樣本類型、樣本采集后處理、所用培養(yǎng)基、相關(guān)藥物和具體操作步驟等、申報產(chǎn)品從培養(yǎng)物中取樣進行檢測的時間點、取樣方法和對培養(yǎng)物樣本的處理等。

5.4樣本的其他處理、運送和保存：明確核酸提取純化前的其他處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限（短期和長期）以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

6.【適用儀器】所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

7.【檢驗方法】詳細(xì)說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述待測樣本及相關(guān)對照核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用）。

7.4擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動化檢測程序及相關(guān)注意事項。

7.6儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對待測突變及內(nèi)標(biāo)和其他對照的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照、內(nèi)對照、核酸提取純化對照（如適用）、樣本管檢測結(jié)果以及已驗證的突變類型與耐藥之間的關(guān)系，以列表的形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測灰區(qū)（如：耐藥不確定等），應(yīng)詳述對于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產(chǎn)品僅對下述突變類型xx進行了驗證。對于c類產(chǎn)品，在此處明確境內(nèi)臨床試驗做過驗證的突變類型。

9.2 申報產(chǎn)品的檢測結(jié)果僅作為初篩結(jié)果，僅供臨床參考，用于輔助診斷結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的耐藥性，不應(yīng)作為患者耐藥的確診依據(jù)。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、療效及其他實驗室檢測指標(biāo)等因素對檢測結(jié)果進行綜合判斷。

9.3本產(chǎn)品僅檢測靶標(biāo)區(qū)域內(nèi)突變引起的耐藥。由其他基因或基因區(qū)域的突變、以及其他耐藥機制引起的耐藥本產(chǎn)品不能檢出。

9.4本產(chǎn)品不能用于監(jiān)測患者對于抗生素的治療進展以及成功與否，因為經(jīng)過抗菌治療后，細(xì)菌DNA可能仍舊存在。

9.5有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

9.5.1不合理的樣本采集、運送及處理、樣本中細(xì)菌含量過低、核酸過度降解或擴增反應(yīng)體系中靶標(biāo)濃度低于檢測限均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.5.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】簡述以下性能指標(biāo)：

10.1對國家參考品檢測的符合情況，簡要描述采用國家參考品進行檢測的結(jié)果（如適用）。

10.2最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結(jié)果。重點考慮原始模板中突變序列的百分率和擴增終體系中核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響。

10.3陽性/陰性參考品符合率。

10.4精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

10.5分析特異性

10.5.1野生型驗證：應(yīng)采用不同濃度的野生型樣本進行驗證，結(jié)果應(yīng)均為陰性。

10.5.2可檢測突變之間的交叉反應(yīng)：如申報產(chǎn)品可檢測多種突變，還需驗證申報產(chǎn)品聲稱的所有突變類型之間是否存在交叉反應(yīng)。

10.5.3干擾物質(zhì)驗證：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

10.6對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

11.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

（九）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）的相關(guān)規(guī)定。申請人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求，內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標(biāo)和檢驗方法，并以附錄的形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定要求。

該類試劑的注冊檢驗主要包括以下性能指標(biāo)：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度和最低檢測限等。陽性參考品主要考察對申報產(chǎn)品覆蓋范圍內(nèi)不同突變類型的檢測符合性，陰性參考品則重點對申報產(chǎn)品的分析特異性進行驗證。

如果申報產(chǎn)品已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則產(chǎn)品技術(shù)要求不得低于國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

（十）注冊檢驗

根據(jù)《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進行連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢驗。對于已有國家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品的檢測項目，在注冊檢驗時應(yīng)采用相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品進行檢驗，并符合相關(guān)要求。對于目前尚無國家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品的項目，申請人應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。對于c類預(yù)期用途的產(chǎn)品，如果沒有國家參考品，注冊檢驗可采用企業(yè)參考品對國內(nèi)已報告的常見突變類型進行驗證。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽性參考品”。

三、名詞解釋

1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction, PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種對特定的DNA或RNA片段在體外進行快速擴增的方法。由變性—退火—延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

2.熒光探針PCR

在PCR過程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產(chǎn)物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達到對原始模板量進行分析的PCR。

3.分析特異性 analytical specificity

測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。

4.精密度 precision

在規(guī)定條件下，相互獨立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

5.最低檢測限 detection limit, limit of detection

樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測量的最低值。

6.閾值循環(huán)數(shù) cycle threshold, Ct

實時監(jiān)測擴增過程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達指數(shù)擴增時經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計算方式是以擴增過程前3到15個循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過閾值時的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。

7.內(nèi)標(biāo) internal control在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。