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乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測試劑

注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

（一）臨床背景

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV 感染的流行強度差異很大。全國2006年乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查表明，我國1-59歲一般人群乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性率為7.18%，2014年中國疾病預(yù)防控制中心開展的全國1—29歲人群乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，1—4歲、5—14歲、15—29歲人群HBsAg陽性率分別為0.32%、0.94%和4.38%，我國現(xiàn)有HBV感染者約有8000萬。在臨床治療慢性乙型肝炎病毒感染的方案中，使用抗病毒藥物是最主要的手段?？?/span>HBV藥物主要包括干擾素α和核苷（酸）類似物兩大類，其中核苷（酸）類藥物服用便捷，抗病毒效力強，不良反應(yīng)較小，但核苷（酸）類藥物在抗HBV治療中需要長期服藥，一旦出現(xiàn)病毒耐藥，可能導(dǎo)致治療失敗、病毒DNA反彈、肝功能惡化甚至肝衰竭。因此，如何發(fā)現(xiàn)病毒耐藥突變，進而合理調(diào)整治療方案，在慢性乙型肝炎臨床治療中具有極其重要的意義。

HBV屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），HBV基因組含有4個部分重疊的開放讀框（ORF），即前-S/S區(qū)、前-C/C 區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。其中P區(qū)編碼聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶，目前已知的核苷（酸）類藥物的耐藥突變均發(fā)生在HBV的P區(qū)。HBV雖然屬于DNA病毒，但其復(fù)制需經(jīng)過以前基因組RNA為復(fù)制中間體的逆轉(zhuǎn)錄過程。在此過程中，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶由于缺乏嚴(yán)格的校正機制，導(dǎo)致HBV復(fù)制過程中核苷酸錯配率較高。HBV復(fù)制的這種過程和特點，導(dǎo)致同一患者體內(nèi)不同的HBV株基因序列之間也存在差異，因此，每一個患者體內(nèi)的病毒都是由不同基因序列的病毒株組成的動態(tài)變化的病毒準(zhǔn)種，不同基因序列的病毒株在病毒準(zhǔn)種中所占的相對比例，一方面取決于病毒株自身的復(fù)制能力，另一方面也受到機體免疫系統(tǒng)或藥物的選擇壓力的影響。

抗病毒藥物核苷（酸）類似物進入機體后，形成三磷酸活性成分，與機體天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競爭性結(jié)合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA鏈合成終止。如果患者體內(nèi)的HBV P區(qū)序列發(fā)生突變，導(dǎo)致產(chǎn)生的HBV聚合酶與核苷（酸）類似物結(jié)合力降低，突變的HBV即不受核苷（酸）類似物的抑制或抑制能力下降，在繼續(xù)應(yīng)用核苷（酸）類似物治療的情況下，突變株病毒由于對核苷（酸）類似物不敏感而逐漸成為優(yōu)勢株，從而導(dǎo)致患者對于核苷（酸）類似物的耐藥。

乙型肝炎病毒的耐藥突變分為原發(fā)性耐藥突變和補償性耐藥突變，原發(fā)性耐藥突變指藥物作用靶位的基因及其編碼的氨基酸發(fā)生突變，導(dǎo)致突變病毒株對治療藥物的敏感性下降。雖然原發(fā)性耐藥突變株對藥物的抵抗性增加，但也常導(dǎo)致突變病毒本身的復(fù)制能力下降。補償性耐藥突變指由于原發(fā)性耐藥突變病毒株復(fù)制能力下降，在原發(fā)性耐藥突變的基礎(chǔ)上，病毒株在其它位點發(fā)生突變，這些突變可部分恢復(fù)突變病毒的復(fù)制能力或可導(dǎo)致突變病毒對藥物敏感性的進一步下降。

目前經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于抗HBV治療的核苷（酸）類似物有拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定（LdT）、替諾福韋酯（TDF）和富馬酸丙酚替諾福韋（TAF）等。與拉米夫定常見耐藥相關(guān)的突變?yōu)?/span>rtM204I/V和rtL180M，其中rtM204V多與rtL180M聯(lián)合出現(xiàn)，rtM204I可單獨出現(xiàn)。與阿德福韋酯常見耐藥相關(guān)的突變?yōu)?/span>rtN236T與rtA181V/T，兩個位點可單獨或聯(lián)合出現(xiàn)。與恩替卡韋常見耐藥相關(guān)的突變是在rtM204V+rtL180M基礎(chǔ)上，再聯(lián)合rtT184、rtS202或rtM250三個位點中至少一個位點的氨基酸替代突變。與替比夫定常見耐藥相關(guān)的突變?yōu)?/span>rtM204I，其它位點如rtA181V/T等尚存在爭議。替諾福韋酯和富馬酸丙酚替諾福韋目前尚未發(fā)現(xiàn)確認(rèn)的耐藥突變。

HBV耐藥相關(guān)的檢測主要包括基因型耐藥檢測和體外表型分析等。

HBV基因型耐藥檢測是指采用分子生物學(xué)方法檢測已在體外表型分析中被證實與抗病毒藥物耐藥相關(guān)的HBV突變的臨床檢測。目前已批準(zhǔn)產(chǎn)品采用的方法主要包括：PCR-測序法（direct PCR sequencing）、基因芯片法（gene chip）、PCR-反向雜交法（PCR-reverse hybridization assay）、實時熒光PCR法（real-time PCR）等。

HBV體外表型分析（in vitro phenotypic analysis）是公認(rèn)的確認(rèn)耐藥的檢測方法，通過體外復(fù)制系統(tǒng)證實檢測到的HBV突變會降低其對抗病毒藥物的敏感性，常用半數(shù)有效濃度（50% effective concentration，EC₅₀）或半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC₅₀）來評價耐藥程度的高低。其方法是將含有待檢測耐藥突變位點的HBV全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞來源的細(xì)胞系，再將不同濃度梯度的核苷（酸）類似物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過一定培養(yǎng)時間后檢測藥物作用下HBV DNA的復(fù)制情況，計算EC₅₀，通過與野生株病毒的EC₅₀比較，判斷該突變對核苷（酸）類似物的敏感性。當(dāng)抑制病毒復(fù)制所需的EC₅₀與野生株相比增加l00倍以上稱為高度耐藥、l0—99倍為中度耐藥、2—9倍為輕度耐藥。

（二）本指導(dǎo)原則適用范圍

本指導(dǎo)原則所述乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測試劑是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，對人體血清/血漿樣本中乙型肝炎病毒耐藥突變位點進行定性檢測的試劑。臨床適用人群為核苷（酸）類似物治療過程中出現(xiàn)病毒學(xué)突破的患者。除非有明確證據(jù)表明初治患者感染HBV來自接受核苷（酸）類似物抗病毒治療患者，一般不主張對初治患者進行基因型耐藥檢測。

本指導(dǎo)原則是基于實時熒光PCR方法對產(chǎn)品相關(guān)申報資料提出要求，其他方法學(xué)的產(chǎn)品可依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內(nèi)容是否適用，如不適用，可另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評價方法。

本指導(dǎo)原則適用于進行產(chǎn)品注冊和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價以及同類產(chǎn)品批準(zhǔn)上市情況及異同比較等內(nèi)容，其中，預(yù)期用途應(yīng)明確所檢測的耐藥突變位點，所檢測的耐藥突變位點與相應(yīng)藥物的相關(guān)性，該突變位點為原發(fā)性耐藥突變還是補償性耐藥突變，耐藥性突變對藥物敏感性的影響，相應(yīng)藥物累積耐藥發(fā)生率以及是否有交叉耐藥等。同類產(chǎn)品情況應(yīng)著重從所檢耐藥突變位點、相關(guān)產(chǎn)品所采用的技術(shù)方法、性能指標(biāo)、臨床應(yīng)用情況以及境內(nèi)外批準(zhǔn)上市情況等方面闡述申請注冊產(chǎn)品與境內(nèi)外同類產(chǎn)品的異同等。對于新的耐藥突變位點，需要提供新位點與預(yù)期藥物敏感性之間關(guān)系的文獻資料，包括但不限于國內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R，以及基于中國人群的充分的臨床數(shù)據(jù)等。

綜述資料的撰寫應(yīng)符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）（以下簡稱44號公告）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料研究資料

以實時熒光PCR方法為例，應(yīng)提供引物、探針、DNA聚合酶、dNTP、尿嘧啶糖基化酶（如有）等主要原材料的選擇與來源、制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料、質(zhì)控品的確認(rèn)試驗資料以及企業(yè)參考品的原材料選擇、來源、質(zhì)量指標(biāo)、制備方法及陰陽性的確認(rèn)過程等的研究資料。

若主要原材料為企業(yè)自行生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定，并提交主要原材料制備過程的研究資料；如主要原材料購自其他供應(yīng)商，則需針對供應(yīng)商的選擇提供評價數(shù)據(jù)，并提供供應(yīng)商出具的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及申請人對該原材料進行的質(zhì)量檢驗資料。

1. 核酸分離/純化組分（如有）的原理介紹、主要組成、主要原材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)驗證資料。

2. 引物和探針：包括申報產(chǎn)品檢測靶序列的引物和探針以及內(nèi)對照的引物和探針。應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計和篩選的過程，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應(yīng)情況，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度檢查、濃度檢查及功能性實驗等。

3. 酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：

3.1 DNA聚合酶應(yīng)包括DNA聚合酶活性、無核酸內(nèi)切酶活性、熱啟動能力（如適用）、熱穩(wěn)定性等。

3.2如申報產(chǎn)品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，應(yīng)對其酶活性及熱穩(wěn)定性等質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進行規(guī)定，如使用其他工具酶，應(yīng)提供其詳細(xì)的研究資料。

4. dNTP：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括純度、濃度、保存穩(wěn)定性及功能性實驗等。

5. 試劑盒質(zhì)控品

試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種試劑盒質(zhì)控品來實現(xiàn)。對于此類產(chǎn)品，質(zhì)控體系主要包括陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和內(nèi)對照。申請人應(yīng)明確質(zhì)控品的原料來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控品陰陽性的確認(rèn)方法，并提交相關(guān)驗證資料。各種質(zhì)控品均應(yīng)參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟，并且與被測臨床樣本在整個試驗過程中保持相同的檢測方式，質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與實際檢測樣本基質(zhì)一致或接近。

有關(guān)質(zhì)控品和內(nèi)對照的具體要求包括以下幾個方面：

5.1陽性質(zhì)控品中應(yīng)包含試劑盒所檢測的主要突變類型，建議采用含有滅活乙肝病毒或假病毒的樣本。企業(yè)應(yīng)對陽性質(zhì)控品的檢測結(jié)果做出明確的范圍要求（如Ct值）。

5.2陰性質(zhì)控品應(yīng)包含未發(fā)生耐藥突變的野生型乙肝病毒核酸，可采用含有滅活乙肝病毒或假病毒的樣本，對可能存在的交叉污染產(chǎn)生的假陽性結(jié)果進行質(zhì)量控制。

5.3內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針設(shè)計和模板濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內(nèi)對照的檢測結(jié)果亦應(yīng)做出明確的范圍要求（如Ct值）。

6. 企業(yè)參考品：應(yīng)提交有關(guān)企業(yè)參考品的原料選擇、制備、陰陽性確認(rèn)等試驗資料。企業(yè)參考品應(yīng)充分考慮產(chǎn)品性能驗證的需要進行設(shè)置。具體要求如下：

6.1陽性參考品

陽性參考品制備應(yīng)采用經(jīng)滅活的、待測乙肝病毒耐藥突變陽性的樣本，通過測序、同類已上市產(chǎn)品檢測或者其他恰當(dāng)?shù)姆椒ù_認(rèn)耐藥突變情況。陽性參考品應(yīng)包含試劑盒所能檢測的所有耐藥突變位點，對于罕見突變型或復(fù)雜突變型可采用假病毒樣本。

6.2陰性參考品

陰性參考品制備應(yīng)采用經(jīng)滅活的、確認(rèn)靶序列未發(fā)生待測突變的乙肝病毒陽性樣本，樣本類型與適用樣本類型一致。同時應(yīng)盡量包含適用范圍以外的其它乙肝病毒基因突變陽性樣本，和其它病原體陽性樣本。

6.3檢測限參考品

可選擇最低檢測限水平或略高于檢測限的水平，明確參考品中乙肝病毒核酸濃度和乙肝病毒基因突變百分率，應(yīng)包含所有的耐藥突變位點，采用適當(dāng)?shù)年栃詸z出率（如95%（n≥20））作為最低檢測限參考品的評價標(biāo)準(zhǔn)。檢測限參考品可采用經(jīng)滅活的、待測乙肝病毒耐藥突變陽性樣本和假病毒等模擬核酸樣品進行適當(dāng)?shù)呐渲啤?/span>

6.4精密度參考品

精密度參考品應(yīng)包含申報產(chǎn)品聲稱的主要耐藥突變位點，試劑盒包含不同反應(yīng)體系時，精密度參考品應(yīng)至少包含每個反應(yīng)體系的代表性位點，并至少包括弱陽性（低濃度突變）水平。精密度參考品制備應(yīng)采用經(jīng)滅活的、待測乙肝病毒耐藥突變陽性的樣本。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1. 介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2. 反應(yīng)原理介紹。

3. 詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設(shè)置，提供相關(guān)的研究資料。

4. 確定最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括樣本類型、樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。

5. 不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

6. 如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對核酸分離/純化過程進行工藝優(yōu)化的研究資料。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交產(chǎn)品研制階段對試劑盒進行的所有性能評價的研究資料，對于每項分析性能的評價都應(yīng)包括具體研究目的、試驗方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗證的背景信息也應(yīng)在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點、適用儀器、試劑規(guī)格、批號和臨床樣本來源等。

分析性能評價的試驗方法可以參考相關(guān)的美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評估的指導(dǎo)原則進行。各項性能評價應(yīng)符合以下要求。

1. 核酸分離/純化性能（如適用）

在進行靶核酸檢測前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂岱蛛x/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸分離/純化試劑針對聲稱樣本類型的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細(xì)的驗證資料。

2. 準(zhǔn)確度

采用多份包含及不包含待測突變位點的HBV核酸陽性臨床樣本，將試驗用體外診斷試劑與Sanger測序或已上市同類產(chǎn)品等進行對比試驗，評價檢測結(jié)果一致性。樣本應(yīng)包括所有陽性突變位點，并包含不同濃度水平。

考慮到同一耐藥突變發(fā)生在不同基因型毒株時對檢測準(zhǔn)確度的影響，準(zhǔn)確度評價中應(yīng)適當(dāng)納入各種HBV基因型（至少包括B、C、D型）樣本，若某些基因型的耐藥突變較為罕見，可以采用假病毒樣本。

3. 最低檢測限

針對所有待測突變位點進行評價，建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。對于此類產(chǎn)品，擴增反應(yīng)終體系中的耐藥突變序列所占百分率和總核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中耐藥突變序列所占百分率越高、所含的總DNA量越多，則越容易檢出。因此，試劑盒最低檢測限評價主要考慮以下兩個方面。

3.1在擴增反應(yīng)終體系特定核酸濃度下，耐藥突變序列所占百分率的最低檢測限。

采用野生型臨床樣本和具有目標(biāo)基因突變的假病毒樣本提取的核酸儲備液進行不同比例混合，確定擴增反應(yīng)終體系中的核酸濃度，并逐漸調(diào)整野生型和耐藥突變型核酸儲備液的比例以得到含不同突變序列百分率的混合液。對各份混合液進行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率水平下的最低百分率，作為在固定的核酸濃度條件下，可以檢測到的最低的突變序列百分率。

3.2在特定突變序列百分率下，反應(yīng)終體系中核酸濃度的最低檢測限。

采用野生型臨床樣本和具有目標(biāo)基因突變的假病毒樣本提取的核酸儲備液進行特定比例混合，再逐級稀釋成不同核酸濃度樣本，分別對各梯度濃度樣本進行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率的最低核酸濃度。

4.精密度

應(yīng)對每項精密度評價指標(biāo)的接受標(biāo)準(zhǔn)做出合理規(guī)定，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求：

4.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對分析儀、操作者、時間、地點、檢測輪次等要素進行相關(guān)的驗證。

4.2應(yīng)針對所有待測突變位點進行精密度驗證。使用臨床樣本進行評價，樣本濃度水平應(yīng)至少包含弱陽性和中/強陽性，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅芏仍u價中的每一次檢測均應(yīng)從核酸提取開始。

4.3合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。

5.分析特異性

5.1交叉反應(yīng)

HBV耐藥突變檢測試劑交叉反應(yīng)驗證應(yīng)考慮HBV各種基因突變及其它病原體的交叉反應(yīng)性，申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病原體、臨床樣本的來源、種屬、型別、基因突變情況和濃度確認(rèn)等試驗資料。

5.1.1核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀的其它病原體，或待檢測樣本中可能共存的其它病原體核酸的交叉反應(yīng)，應(yīng)采用待測核酸序列陰性、其它核酸高濃度樣本進行交叉反應(yīng)的驗證，如：人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人巨細(xì)胞病毒、E-B病毒、梅毒螺旋體、人類皰疹病毒6型、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、甲型流感病毒、痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等。

5.1.2申報產(chǎn)品包含的不同耐藥突變位點之間的交叉反應(yīng)，以及申報產(chǎn)品不包含的其它HBV基因突變對被檢測位點的影響等。如：rtL180M、rtA181V/T、rtT184、rtS202、rtM204I/V、rtN236T、rtM250等突變位點之間的交叉反應(yīng)。

5.2干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性干擾物質(zhì)和外源性干擾物質(zhì)。

5.2.1內(nèi)源性干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等。

5.2.2外源性干擾物質(zhì)：常用抗凝劑，臨床常用抗病毒藥物如：干擾素、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋酯和富馬酸丙酚替諾福韋等對檢測結(jié)果的影響。

5.2.3建議在待測核酸的臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進行檢測，并針對各種耐藥突變序列分別進行評價。干擾物濃度的分布應(yīng)覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質(zhì)濃度。應(yīng)注明不同干擾物質(zhì)對被檢測物質(zhì)無干擾的最高限值。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值即為針對每個突變基因能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cutoff），對于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料。建議采用受試者工作特征曲線（ROC）的方式進行相關(guān)研究。申請人應(yīng)選取適當(dāng)?shù)淖銐驍?shù)量的臨床樣本進行試驗以確定陽性判斷值。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

樣本穩(wěn)定性研究，可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行分析驗證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。

對于樣本進行核酸提取后不能立即進行檢測的，應(yīng)明確提取核酸的儲存條件、儲存時間等內(nèi)容，同時應(yīng)提供相應(yīng)的核酸穩(wěn)定性研究資料。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細(xì)說明。

（七）產(chǎn)品風(fēng)險分析資料

申請人應(yīng)參考YY/T 0316《醫(yī)療器械 風(fēng)險管理對醫(yī)療器械的應(yīng)用》規(guī)定的過程和方法，在產(chǎn)品生命周期內(nèi)可能造成的危害進行識別，對每一危害處境的風(fēng)險進行判定和評價，形成風(fēng)險管理報告，控制這些風(fēng)險并監(jiān)視控制的有效性，充分保證產(chǎn)品的安全性和有效性。

（八）臨床試驗

臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗應(yīng)符合更新后的要求。

1.臨床試驗方法

1.1已有同類產(chǎn)品上市的情形

選擇已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑，進行比較研究，評價耐藥突變位點的檢測性能。

對比試劑的選擇應(yīng)從預(yù)期用途、樣本要求、檢測性能等方面，確認(rèn)其與試驗用體外診斷試劑具有較好的可比性，并提交相應(yīng)的比對資料。

1.2無同類產(chǎn)品上市的情形

1.2.1如新的乙肝病毒耐藥突變位點用于乙肝用藥指導(dǎo)已獲行業(yè)認(rèn)可（包括：國內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R、相關(guān)藥物說明書、臨床應(yīng)用等的認(rèn)可），在無同類產(chǎn)品上市的情況下，臨床試驗中可選擇Sanger測序法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄗ鳛閷Ρ确椒ㄟM行比較研究，評價耐藥突變位點的檢測性能。

1.2.2如新的乙肝病毒耐藥突變位點用于乙肝用藥指導(dǎo)尚未獲行業(yè)認(rèn)可，臨床試驗應(yīng)包括兩個試驗?zāi)康?，耐藥突變位點檢測性能評價及耐藥突變與抗病毒藥物敏感性的相關(guān)性評價。耐藥突變位點檢測性能評價可參考1.2.1的試驗方法，耐藥突變與抗病毒藥物敏感性的相關(guān)性評價，應(yīng)以體外表型分析作為參考標(biāo)準(zhǔn)，評價突變位點與體外表型分析的一致性。

針對Sanger測序和體外表型分析方法的建立、驗證和質(zhì)量控制，應(yīng)提交詳細(xì)的研究論述，相關(guān)內(nèi)容納入臨床試驗報告中。

2.受試者選擇和樣本例數(shù)

2.1受試者選擇：臨床試驗受試者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品聲稱的適用人群進行選擇，應(yīng)包含各種突變型樣本，以及各種可能的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本（其它病原體陽性）等。

2.2樣本例數(shù)

臨床試驗樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進行估算。根據(jù)相應(yīng)臨床試驗設(shè)計，本臨床試驗可依據(jù)試驗用體外診斷試劑相對于對比試劑的陰、陽性符合率或相對于臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度和特異度分別估算最低陰、陽性樣本例數(shù)。

2.2.1耐藥突變位點檢測性能評價的樣本量估算

對于耐藥突變位點檢測性能的評價，臨床樣本量的估算建議采用如下樣本量公式計算，

公式中，n為樣本量；Z_1-α、Z_1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P₀為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，P_T為試驗用體外診斷試劑評價指標(biāo)預(yù)期值。

以已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑的比較研究中，陰陽性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）建議不低于95%，若以Sanger測序法作為對比方法，臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）可適當(dāng)降低。應(yīng)證明產(chǎn)品與對比試劑/方法的陰陽性符合率（可信區(qū)間下限）不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）。當(dāng)評價指標(biāo)P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

如申報產(chǎn)品為多突變位點檢測試劑，則其中常見的突變位點陽性樣本例數(shù)應(yīng)分別具有統(tǒng)計學(xué)意義，罕見的突變位點應(yīng)有一定的陽性樣本例數(shù)，保證臨床性能得到充分的確認(rèn)。

2.2.2新基因突變位點與抗病毒藥物敏感性的相關(guān)性評價的樣本量估算

樣本量的估算可采用如下抽樣調(diào)查的公式計算：

公式中n為樣本量，Z_1-α/2為置信度標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分位數(shù)，P為評價指標(biāo)預(yù)期值，Δ為P的允許誤差大小。應(yīng)注意，P和Δ的取值應(yīng)有充分依據(jù)，其中Δ的常用取值為0.05，但當(dāng)預(yù)期值更高時應(yīng)考慮更優(yōu)的精度。

2.2.3臨床試驗總體樣本量確定時應(yīng)在上述陰、陽性樣本最低樣本量估算的基礎(chǔ)上，同時考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及可能需要納入的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本等情況適當(dāng)增加入組樣本量。

此類產(chǎn)品的檢測樣本類型一般為血清或血漿，如果樣本類型同時包括血清和血漿，且臨床前研究證明兩種樣本類型檢測一致性較好，則臨床試驗可以其中一種樣本類型為主完成如上臨床試驗，同時另一種樣本類型采用一定數(shù)量樣本進行對比試驗（同源樣本對比或同類產(chǎn)品對比）驗證即可，其中應(yīng)包括一定數(shù)量的陽性和陰性樣本，陽性樣本中盡量包含預(yù)期適用的所有突變位點。

3.臨床研究單位的選擇

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）臨床試驗機構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開展臨床試驗。臨床試驗機構(gòu)的選擇應(yīng)充分考慮擬申報產(chǎn)品的特點和預(yù)期用途，綜合流行病學(xué)背景，使臨床試驗機構(gòu)和受試者的選擇具有一定的地域代表性。實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉臨床試驗方案。

4. 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法對臨床試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，對于試驗用體外診斷試劑與對比試劑（方法）/參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性評價，常選擇交叉四格表形式總結(jié)兩種試劑/方法的檢測/診斷結(jié)果，評價指標(biāo)一般包括臨床靈敏度、臨床特異度、陽性符合率和陰性符合率等。

對于此類產(chǎn)品，每種突變類型均應(yīng)分別進行統(tǒng)計學(xué)分析，對于不一致樣本，應(yīng)進行可能的原因分析，如臨床試驗方案規(guī)定采用其他方法進行確認(rèn)，則確認(rèn)結(jié)果不應(yīng)納入統(tǒng)計分析。

5.倫理學(xué)要求

臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結(jié)果對受試者的風(fēng)險，提請倫理委員會審查，并獲得倫理委員會的同意。注冊申報時應(yīng)提交倫理委員會的審查意見。

6.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構(gòu)應(yīng)執(zhí)行統(tǒng)一的臨床試驗方案，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。

7.質(zhì)量控制

臨床試驗開始前，建議進行臨床試驗的預(yù)試驗，以熟悉并掌握相關(guān)試驗方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及精密度。

8.臨床試驗報告撰寫

臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法，最后得出臨床試驗結(jié)論。臨床試驗報告的撰寫參考《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（九）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、前期性能評估等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。

該試劑的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)主要包括：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。性能指標(biāo)應(yīng)依據(jù)分析性能評估試驗結(jié)果確定，檢驗方法應(yīng)明確具體操作方法和使用的樣本及參考品情況。

該產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑，申請人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求。

（十）產(chǎn)品檢驗報告

應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品技術(shù)要求，在符合《辦法》要求的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進行連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的檢驗，提供檢驗合格報告。

（十一）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗方法、檢驗結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達習(xí)慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預(yù)期用途】

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自乙型肝炎病毒核酸陽性患者的血清/血漿樣本中的×××（具體的突變型）耐藥突變。本產(chǎn)品用于對×××藥物耐藥的輔助診斷。

1.2適用人群：應(yīng)為核苷（酸）類似物治療過程中出現(xiàn)病毒學(xué)突破的乙型肝炎患者，除非有明確證據(jù)表明初治患者感染乙肝病毒來自于接受核苷（酸）類似物抗病毒治療患者。一般不主張對初治患者進行基因型耐藥檢測。

1.3簡要介紹乙型肝炎病毒耐藥突變位點的特征，包括突變位點的描述，所檢測的耐藥突變位點與相應(yīng)藥物的相關(guān)性。

1.4強調(diào)該試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為治療藥物調(diào)整的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實驗室檢測指標(biāo)等因素對患者治療進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

詳細(xì)說明試劑盒檢測技術(shù)原理，包括核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的耐藥突變位點信息；介紹引物及探針設(shè)計、不同樣品反應(yīng)體系（管）組合、質(zhì)控品設(shè)置及熒光信號標(biāo)記等。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應(yīng)對其作用機理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成分】

詳細(xì)說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、貨號以及醫(yī)療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細(xì)信息。當(dāng)試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時，應(yīng)在此注明經(jīng)驗證后可以配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)與相應(yīng)的穩(wěn)定性研究結(jié)論一致。注明“生產(chǎn)日期及有效期至（或失效日期）見標(biāo)簽。”

5.【適用儀器】

明確所有適用的儀器型號，提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】 

明確適用的樣本類型，并詳細(xì)描述樣本采集及預(yù)處理要求、運輸要求、保存條件及期限等。

7.【檢驗方法】

詳細(xì)說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。質(zhì)控品參與樣本核酸的平行提取的要求等。

7.3擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項等。

7.4 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測基因、內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇等。

7.6質(zhì)量控制：說明質(zhì)控品的檢測要求。

8.【陽性判斷值】

簡要總結(jié)陽性判斷值研究方法及結(jié)論。明確說明樣本的陽性判斷值。

9.【檢驗結(jié)果的解釋】

說明質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)的正確結(jié)果要求，結(jié)合質(zhì)控品以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果，對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進行詳述。檢驗結(jié)果的解釋應(yīng)以陽性判斷值的研究結(jié)論為依據(jù)。

10.【檢驗方法的局限性】

應(yīng)至少包括如下描述：

10.1本試劑檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀及其他相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查結(jié)果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據(jù)。

10.2本產(chǎn)品僅檢測靶標(biāo)區(qū)域內(nèi)突變引起的耐藥。由其他基因或基因區(qū)域的突變、以及其他耐藥機制引起的耐藥本產(chǎn)品不能檢出。

10.3不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理以及不當(dāng)?shù)膶嶒灢僮骱蛯嶒灜h(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。

10.4未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述分析性能評估的試驗結(jié)果并簡要描述臨床試驗的基本信息、試驗方法和結(jié)論。

12.【注意事項】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出生物安全性的警告。

12.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

12.3強調(diào)產(chǎn)品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法進行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產(chǎn)品性能。

12.4強調(diào)：實驗操作人員應(yīng)接受過基因擴增或分子生物學(xué)方法檢測的專業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實驗操作資格，實驗室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護程序。

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四、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。